افزایش ارتفاع و سطح برگ گیاهان تراریخت توتون بیانکنندۀ ژن AtEXPA18 آرابیدوپسیس تالیانا

Transcript

1 علوم گیاهان زراعی ایران دورة 54 شمارة پاییز )ص -( افزایش ارتفاع و سطح برگ گیاهان تراریخت توتون بیانکنندۀ ژن آرابیدوپسیس تالیانا *2 1 میثم ملکپور و علیرضا عباسی 1 و 2. کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی و دانشیار پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران کرج )تاریخ دریافت: /1/11 تاریخ تصویب: 1292/7/22( چکیده اکپنسینها گروهی از پروتئینهای دیوارۀ سلولیاند که بهواسطۀ تغییرات ph موجب بسط دیوارۀ سلولی میشوند. این پروتئینها از طریق سست کردن پیوندهای هیدروژنی بین میکروفیبریلهای سلولز و پلیمر ماتریکس موجب تغییر شکل دیواره و رشد میشوند. در یک تحقیق این ژن اختصاصی ریشه از گیاه آرابیدوپسیس به نام بهطور که مستقیم در شکلگیری ریشههای مویین مؤثر است همچنین نقش آن در دیگر بخشهای گیاهی ثابت شده است جداسازی و تحت کنترل پیشبرندۀ و CaMV 5S pbi121 خاتمهدهندۀ NOS درون ناقل بیان گیاهی همسانهسازی و در نهایت به آگروباکتری منتقل شد. سپس این ژن طی روش تراریختی برگی توتون به این گیاه انتقال یافت. گیاهان حاصل از باززایی روی محیط انتخابی حاوی کانامایسین گزینش شدند. گیاهان بهدستآمده از این طریق در نهایت به گلخانه انتقال یافتند و پس از رشد کافی مورد آنالیز مولکولی و مورفولوژیکی قرار گرفتند. برای اثبات تراریختی گیاهان در سطح ژنوم استخراج دیانای صورت گرفت و ژن با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده و از طریق واکنش زنجیرهای پلیمراز تکثیر شد. همچنین پس از استخراج و ساخت RNA آزمون RT-PCR رونویسی تراژن را در گیاهان تراریخت تأیید کرد. بررسیهای cdna نتایج مورفولوژیکی گیاهان تراریخت نشان داد که این گیاهان نسبت به گیاهان غیرتراریخت دارای اندامهای بزرگتر و حجیمتری هستند. برای مثال صفاتی ارتفاع همچون بوته و سطح توتونه یا در برگها تراریخت نسبت به گیاهان شاهد برتری معنیداری داشتند. نتایج بهدستآمده بههمراه سایر نتایج نقش ژن مذکور را در بسط و توسعۀ سلولی نشان میدهند و آن را بهعنوان تنظیمکنندۀ رشد عمومی برای بهدست آوردن گیاهان تراریخته با اندام بزرگتر توصیه میکنند. واژههای کلیدی: اکسپنسین اگروباکتریومتومفشینس بسط دیوارۀ سلولی تراریختی. که مقدمه اندازه و شکل اندامهای گیاهی صفات بسیار ن مهمیاد بهشدت تحت کنترل ژنتیکی اندامهای گیاهی از طریق نهایی اندازة هستند. دو عامل اندازه و تعداد سلولها تعیین میشود بنابراین امکان تغییر اندازة اندام توسط دستورزی تقسیم و توسعۀ سلولی وجود دارد. افزایش حجم سلول اغلب بهسبب جذب آب توسط واکوئل مرکزی رخ میدهد اما بهدلیل سختی و استحکام دیوارة سلولی بزرگ شدن سلول تنها زمانی اتفاق میافتد که اتصاالت میکروفیبریل سلولز نرم و شکسته شود. بنابراین سلول گیاهی برای طویل شدن یا بلوغ به تغییر انتخابی دیوارة سلولی نیاز دارد. عواملی که در تغییر دیوارة سلوله یا گیاهی نقش دارند شامل اجزای مختلف دیوارة سلولی مانند اکسپنسینها rezabbasi@ut.ac.ir * تلفن:

2 علوم گیاهان زراعی ایران دورة 54 شمارة پاییز 9 اندوگلوکانازها زایلوگلوکان اندوترانس گلیکوزیالز و رادیکاله یا هیدروکسیل است.)Cosgrove, 1999( اکپنسینها گروهی از پروتئینهای دیوارة سلولیاند که بهواسطۀ تغییرات ph موجب بسط دیوارة سلولی میشوند و اولین بار در سال 4 از دیوارة سلولی هیپوکوتیل گیاه خیار جداسازی شدند ( McQueen-.)Mason et al., 1992 گونههای گیاهی دیگر نیز شناسایی شدند این پروتئینها سپس در Rose et al., (.)2000; Powell et al., 200; Wang et al., 2006 چهار خانواده از ژنهای اکسپنسین شناسایی شدهاند که شامل β-expansins α-expansins (EXPA) Expansin-like A (EXPLA) (EXPB) و ExpansinlikeB (EXPLB) هستند.)Choi et al., 2006( اکپنسینها در گیاهان توسط چندین ژن کد میشوند. برای مثال ژنوم آرابیدوپسیس دارای ژن اکسپنسین است 4 ژن برای برای ژن ژن برای EXPB EXPA و ژن برای EXPLA.EXPLB در مقایسه با آرابیدوپسیس ژنوم برنج دارای 4 ژن اکسپنسین شامل 5 ژن EXPLA ژن EXPB 5 ژن EXPA است EXPLB.)Sampedro & Cosgrove, 2005( و ژن در حال حاضر با گذشت بیست سال از کشف این پروتئینها بیتردید اکسپنسینها نهتنها در تنظیم بسط سلولی بلکه در تنظیم چندین فرایند مورفوژنتیکی و ساختاری دخیلاند از جمله در رشد ریشه و برگ Wu ( )et al., 2001; Shin et al., 2005 )Choi et al., 200( توسعۀ برگ ( افزایش طول میانگره Fleming et al., )1997; Pien et al., 2001 و توسعۀ گل Zenoni et al., ( )2004 تأثیر میگذارند. تشدید بیان ژن در AtEXPA10 آرابیدوپسیس تالیانا با افزایش طول دمبرگ و سطح برگ همراه شده است همچنین گیاهان تراریخت حامل کپی آنتی-سنس همان ژن برگهای کوچکی را ایجاد کردهاند.)Cho & Cosgrove, 2000( دانشمندان در پژوهشی یک ژن TaEXPB2 را از کلوئوپتیل گندم استخراج و بهمنظور نشان دادن نقش آن در رشد و توسعۀ سلول به گیاه توتون انتقال د دادن و مشاهده کردند که این ژن موجب تسریع رشد برگها و میانگرهها در اوایل رشد شده و همچنین در تنظیم رشد کلی گیاه مؤثر واقع میشود نامه یا مشخص ریشههای شده AtEXP7 مویین است که و بیان AtEXP18 است مرتبط دو بهطور ( اکسپنسین ژن با مؤثری به تولید Cho & Cosgrove,.)2002; Won et al., 2009 در راستای گسترش اندام ریشه و افزایش توانایی گیاه برای جذب آب بیشتر و همچنین افزایش سطوح بخشهای هوایی گیاهان توتون شامل ساقه ژن فراوان برگها و در این پژوهش انتقال تحت کنترل راهانداز و بیان CaMV 5S مدنظر قرار گرفت. مواد و روشها ساخت سازۀ ژنی pbi:expa18 در این تحقیق ژن از دیانای استخراجشدة گیاه آرابیدوپسیس تالیانا جدا و به درون ناقل pgem-t وارد شد. این ناقل نیز بههمراه ژن مورد نظر ابتدا به باکتری Eschrichia Coli DH5α مستعدشده منتقل شد و پس از تکثیر ناقل ژن مورد نظر از آن جدا و به درون ناقل بیانی pbi121 )Clonetech( همسانهسازی Shahnejat شد ( al., 2010 )Bushehri et )شکل.) ساخت از پس سلولهای مستعد به سازه این آن تأیید و ژنی سازة Agrobacterium tumefasciens LBA4404 )Merck( LB از منتقل شد و کلونیهای رشدکرده در محیط انتخابی )حاوی کانامایسین و ریفامپسین( برای تلقیح برگهای توتون استفاده شدند. برای تأیید نهایی حضور سازة ژنی در آگروباکتری از کلونیهای رشدکرده بر روی محیط انتخابی LB بهمنظور انجام کلونی PCR نمونهگیری شد و با استفاده 1 Taq آغازگرهای طراحیشده )جدول ( و توسط آنزیم پلیمراز )شرکت سیناژن( ژن هدف تکثیر و قطعات متناسب با اندازة آن بر روی ژل آگارز مشاهده شد. آغازگرهای مناسب اساس ابتدا و انتهای ژن تکثیر برای EXPA18 2 CDS که هنگام تکثیر ژن طولی برابر با طول ناحیۀ کدکنندة میدادند )شکل 4(. بر این ژن طراحی شده بودند 44 )مطابق با bp )AtEXP18 را بر روی ژل نشان 1. Taq (Thermus aquaticus) DNA Polymerase 2. Coding DNA Sequence.)Xing et al., 2009(

3 ملکپور و عباسی: افزایش ارتفاع و سطح برگ گیاهان تراریخت توتون... شکل. نقشۀ شماتیک سازة ژنی سپس ژن. pbi:expa18 برای ساخت این سازه هضم دوگانۀ ناقل pbi121 با آنزیمهای BamHI و EXPA18 توسط آنزیم کانامایسین و تحت کنترل پیشبر T4 DNA CaMV 5S مناطق مرزی چپ و راست موجود در پالسمید SacI انجام گرفت. لیگاز به درون ناقل pbi121 کلون شد. ناقل دوگانۀ pbi121 دارای نشانگر انتخابی مقاومت به است که موجب بیان ژن در سلولهای موجودات پرسلولی میشود. این پالسمید دارای Ti است که در انتقال T-DNA از آگروباکتریوم به سلولهای گیاهی نقش دارند. جدول. مشخصات مربوط به آغازگرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن.EXPA18 محل شناسایی آنزیمهای برشی مشخص شده است. شکل 4. شمای مربوط به ساختار ژن EXPA18 و محل اتصال آغازگرها بر روی این ژن تراریختی توتون از طریق اگروباکتریوم گیاه توتون از بذرهای پژوهش در این Nicotiana ( )tabacum L. رقم تجاری سامسون )Samsun( برای کشت و از برگهای آن برای تلقیح توسط باکتری استفاده شد. بهمدت یک دقیقه هیپوکلرید ابتدا بذرهای سدیم توتون ضدعفونی شده 19 در الکل 4 درصد و سپس توسط درصد بهمدت ده دقیقه استریله شدند و پس از پنج بار شستوشو با آب مقطر استریل در محیط کشت )ph 5.8( 1 MS کاشته شدند. پس از چهاربرگی شدن گیاهان نمونهگیری از برگ آنها صورت گرفت و همزمان اگروباکتری در محیط کشت مایع LB انتخابی با کانامایسین و ریفامپسین درون فالکون Murashige and Skoog

4 علوم گیاهان زراعی ایران دورة 54 شمارة پاییز 4 biozol TM بهمدت یک شب در انکوباتور با دمای سانتیگراد رشد داده بهمدت سپس شد 4 4 درجۀ دقیقه در 999 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد تا رسوب باکتری جدا شود. سپس محیط تلقیح )که همان مایع بود( MS به رسوب باکتری اضافه شد و دوباره بهمدت -5 ساعت در انکوباتور گذاشته شد تا OD 600 برسد. 4 همچنین برای افزایش توان نهایی باکتری به /- آلودهسازی باکتریها مقداری استوسرینگون به محیط تلقیح اضافه شد. بهمدت نمونههای برگی توسط اسکالپل دو تا یک دقیقه درون محیط زخمی تلقیح و شده حاوی باکتری غوطهور شدند. بهمنظور ارتباط بیشتر باکتری با سلولهای برگی برگهای تلقیحشده در محیط MS همکشت بهمدت سه تا پنج روز در اتاقک تاریکی قرار داده شدند. سپس نمونهها به محیط کشت انتخابی MS گزینش حاوی کانامایسین - با غلظت و سفوتاکسیم تراریختها - 44 بهمنظور µg/ml با غلظت - µg/ml 599 برای جلوگیری از رشد باکتری منتقل شده و در اتاقک رشد با دمای 44 درجۀ سانتیگراد رطوبت 9 و درصد دورة نوری شانزده ساعت روشنایی هشت ساعت تاریکی قرار گرفتند. سلولها تراریخت شروع سبز رشد به باقیمانده پس کردند. در از محیط حدود گیاهچههای انتخابی محیط انتخابی ثانویه با غلظت کانامایسین هفته چهار احتماال به اولیه 49µg/ml انتقال یافتند تا گیاهان غیرتراریخت فرارکرده از محیط انتخابی اول در این مرحله حذف شوند. رشد از پس کافی گیاهان در این محیط آنها به خاک منتقل شده و پس از سازگاری با محیط ابتدا به فیتوتورون و سپس به گلخانه انتقال داده شدند. بررسی گیاهان تراریخت گیاهچهها و گرفتند در پس گلخانه از تحت رشد شرایط کافی آبیاری نمونههای مناسب برگی قرار برای استخراج دی ان ای گرفته شده و به فریزر 9- انتقال و یافت دیانای بهمنظور به آنها از اثبات روش تراریختی CTAB آغازگرهای از استفاده با گیاهان انجام استخراج گرفت. و طراحیشده ژن از طریق واکنش زنجیرهای پلیمراز تکثیر شد. برای تأیید بیان تراژن در گیاهان تراریخت RNA کل با روش شد. سپس استخراج RNA DNase معکوس اندازهگیری تهیۀ cdna و تیمار شد )شرکت فرمنتاز( غلظت محلولهای پایۀ cdna 49 اثبات حضور رونوشت ژن آنزیم توسط ساخته شد و با استخراجی نسخهبردار پس از بهدستآمده با نانودراپ و نانوگرم بر میکرولیتر تراریخت توتون از واکنش زنجیرهای پلیمراز برای در الینهای )RT-PCR( با استفاده از آغازگرهای اختصاصی این ژن استفاده شد. شرایط واکنش همانند واکنشه یا بهج یا تفاوت که با این بود استاندارد PCR از ژنومی DNA قبلی cdna بهعنوان الگو استفاده شد. در نهایت صفات مورفولوژیکی شامل طول ساقه با متر و سطح برگها بهوسیلۀ دستگاه اندازهگیری سطح برگ اندازهگیری شدند. ژن طراحی و شده با نتایج و بحث بهکمک استفاده PCR از آغازگرهای تکثیر حاصله روی ژل آگارز الکتروفورز شد. شد اختصاصی و محصوالت با توجه به شکل در چاهک اول از سمت راست محصول PCR دیانای استخراجشده از گیاه شاهد )بهعنوان کنترل منفی( بارگذاری شد و همانطورکه انتظار میرفت هیچ قطعهای مشاهده نشد. چاهکهای 4 تا 4 و 1 تا حاوی DNA تکثیرشدة گیاهان مورد آزمون هستند. چاهک نیز نشانگر وزن مولکولی را داراست که حاوی الندای DNA آنزیمه یا با هضمشده EcoRI و HindIII است. همچنین پالسمید استخراجشده از اگروباکتری و کلونی باکتری )بهعنوان کنترلهای مثبت( بهترتیب در 9 و چاهکهای DNA بارگذاری شدند. در نهایت قطعات ایجادشده مطالعه شدند. با توجه به اندازة قطعات تکثیرشده در نمونههای دیانای استخراجشده پنج الین تراریخت )L1-L5( که قطعهای همردیف با قطعۀ حاصل از کنترل مثبت و در حدود 44 )طول bp CDS )AtEXP18 را نشان دادند مشخص شدند )شکل (. به این ترتیب تراریختی پنج الین تأیید شد و آنالیزهای بعدی بر روی گرفت. این ژن از گیاهان توتون گیاهان صورت 1. Leaf Area Meter

5 ملکپور و عباسی: افزایش ارتفاع و سطح برگ گیاهان تراریخت توتون... شکل. قطعات حاصل از تکثیر دی ان ای توتون با آغازگرهای ویژة ژن :L5-L1 گیاهان تراریخت مثبت / بر روی ژل آگارز درصد :Plasmid نمونه پالسمید اگروباکتری حاوی ژن مورد نظر )کنترل مثبت( / PCR :Colony کلونی اگروباکتریدار سازة ژنی مورد نظر / )Qiagen( λ /EcoRI+HindIII نشانگر وزن مولکولی :Ladder شکل 5. بذور گیاهان تراریخت بهدلیل دارا بودن ژن مقاومت به کانامایسین میتوانند در محیط کشت حاوی این آنتیبیوتیک رشد کنند )سمت چپ پتریدیشها( ولی گیاهان غیرتراریخت پس از جوانه زدن در این محیط زرد میشوند و از بین میروند )سمت راست پتریدیشها(. الینها را تأیید کرد )شکل 4(. با توجه به این شکل الینهای تراریخت قطعهای همردیف با باند 1 جفت بازی بر روی ژل آگارز ایجاد کردند درحالیکه در گیاه شاهد باندی دیده نشد تا بدین صورت رونویسی تراژن در الینهای تراریخت به اثبات برسد. بررسیهای مورفولوژیکی گیاهان تراریخت نشان داد که این گیاهان نسبت به گیاهان غیرتراریخت اندامهای بزرگتر و حجیمتری دارند. گیاهان تراریخت پس از 4 هفته رشد در محیط گلخانه برتری خود را نسبت به گیاهان شاهد از نظر ارتفاع بوته نشان دادند )شکل ( بهطوریکه ارتفاع ساقۀ این گیاهان در پایان رشد به 54 سانتیمتر نیز رسید درحالیکه اندازة بلندترین گیاه شاهد در حدود 4 سانتیمتر شد )شکل (. نتایج بهدستآمده که از طریق آماری مورد تجزیه قرار گرفت نشان داد که ارتفاع بهمنظور تأیید نتایج PCR و همچنین اثبات انتقال ژن به نسل بعدی )T1( بذرهای گیاهان تراریخت و شاهد جداگانه برداشت شده و پس از ضدعفونی در محیط کشت MS حاوی آنتیبیوتیک کانامایسین µg/ml( 49( در داخل پتریدیش کشت شدند. چون گیاهان تراریخت حاوی ژن مورد نظر ژن مقاومت به کانامایسین را نیز دریافت کردهاند باید در محیط کانامایسیندار قادر به رشد باشند ولی گیاهان غیرتراریخت توانایی رشد در این محیط را نخواهند داشت و پس از جوانه زدن زرد خواهند شد. به این ترتیب هر پنج الینی که تراریختیشان با PCR تأیید شده بود بر خالف گیاهان شاهد و با نسبت : در این محیط کشت بهخوبی رشد کردند و سبز ماندند )شکل 5 (. نتایج حاصل از الکتروفورز محصوالت نیز RT-PCR تراریختی الینهای مورد نظر و رونویسی تراژن در این

6 علوم گیاهان زراعی ایران دورة 54 شمارة پاییز 5 الینهای تراریخت نسبت به گیاهان شاهد غیرتراریخت برتری معنیداری در سطح 4 درصد دارند )جدول 4(. جدول 4. جدول تجزیۀ واریانس برای صفات اندازهگیریشدة منبع تغییرات الینها خطا ضریب تغییرات )%( الینهای تراریخت و شاهد در نسل اول درجۀ آزادی ارتفاع بوته * 4/4 میانگین مربعات سطح برگ ** 14/ 44/55 41/1 9/ 49/4 * ** بهترتیب معنیدار در سطح احتمال 4 و درصد و ns غیرمعنیدار. این اختالف مشاهدهشده در گیاهان تراریخت و شاهد با توجه به شرایط رشدی یکسان نمونهها احتماال دلیلی بر بیان صحیح ژن مورد نظر و عملکرد آن در محل دیوارة سلولی بهعنوان بسطدهندة اندازة سلول است. البته اثبات این ادعا نیازمند آزمایشها و آنالیزهای مربوط به بیان ژن است که در مراحل بعدی پژوهش به اجرا گذاشته خواهند شد. در بررسی دیگر پنج الینی که تراریختی آنها از طریق پیسیآر اثبات شده بود سطوح برگی بزرگتری را نسبت به گیاهان شاهد نشان دادند بهطوریکه افزایش سهبرابری در برخی برگهای گیاهان تراریخت نسبت به گیاه شاهد مشاهده شد )شکل 1 ( که این اختالف بین الینهای تراریخت و شاهد در سطح درصد معنیدار شد )جدول 4(. همچنین در انتهای رشد و رسیدگی کامل این الینها سطح برگی خود را تا حد زیادی حفظ کردند )شکل ( cdna EXPA18 (789 bp) شکل 4. نتیجۀ آزمون RT-PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن ) بر روی ژل آگارز درصد :Ladder نشانگر وزن مولکولی )Qiagen( λ /EcoRI+HindIII 4-( الینهای تراریخت 1( گیاه شاهد ( کنترل منفی که در آن از آب بهجای cdna استفاده شده است. شکل. ارتفاع گیاهان تراریخت در مقایسه با غیرتراریختها پس از 4 هفته رشد در گلخانه شکل 1. سطوح برگی الینهای تراریخت )باال( در مقایسه با شاهد )پایین(

7 4 ملکپور و عباسی: افزایش ارتفاع و سطح برگ گیاهان تراریخت توتون... شکل. ارتفاع و سطح برگ گیاهان تراریخت )L1-L5( در مقایسه با گیاهان شاهد )1,2, )control نتیجهگیری کلی در این پژوهش گیاهان توتون تراریخت با ژن بهدست آمد که دارای اندامهای بزرگتر در مقایسه با شاهد بودند. درحالیکه تشدید بیان برخی از ژنهای اکسپنسین در موارد نادر موجب تشکیل اندامهای کوچک شده است )2010 al.,.)gao et نتایج این تحقیق با نتایج بسیاری از پژوهشهای دیگر همخوانی دارد تشدید بیان این ژنها بر رشد اندامهای گیاهی تأثیر مثبت داشته است ( Cho & Cosgrove,.)2000; Choi et al., 200 رشد ساقه ساقۀ بلند این گیاهان احتماال بهسبب فعالیت بیشتر ژن اکسپنسین در سلولهای نابالغ و جوان میانگره ساقه است که با بسط بیشتر این سلولها افزایش ارتفاع را موجب شده است. در نتایجی مشابه محققان سوئدی گیاه صنوبر ).L )Populus tremula تراریخت با ژن PttEXPA1 را که دارای ساقههای بلند و برگهای بزرگ بود تولید کردند و نشان دادند که فعالیت این ژن بیشتر در کامبیوم و میانگرههای طویل اغلب ناشی از سلولهای بزرگ )نه تعداد سلول بیشتر( بوده است. بهنظر میرسد فعالیت اکسپنسینها عمدتا در سلولهای جوان و تمایزنیافته اتفاق میافتد و با بسط بیشتر این سلولها موجب حجیم شدن آنها و در نهایت افزایش طول کلی ساقه میشود رشد برگ تشریح شبکۀ ژنتیکی که شکل و اندازة برگ را موجب میشوند نه تنها از این نظر اهمیت دارد که گیاهان بهعنوان مهمترین منبع انرژی هستند بلکه برای درک کنترل اندازة سلول در موجودات پرسلولی اهمیت دارند. آغازندههای برگی از کنار مریستم رأسی ساقه )SAM( ظاهر میشوند. طبق شکل عواملی که موجب تبدیل آغازندة این برگی به برگ بالغ میشوند شامل دو فرایندیاند که اشتراکاتی دارند: تقسیم سلولی و توسعۀ سلولی دو رخداد مهمیاند که عامل اصلی تشکیل یک اندام گیاهی بهشمار میروند )2012 al.,.)gonzalez et در طی اولین مرحله تکثیر پرایموردیا رخ میدهد و سلوله یا سلولی در سراسر جدید تولید میکند که اندازة آنها نسبتا ثابت و کوچک باقی میماند. اندازة نهایی برگ تا حدی میتواند از طریق تکثیر سلولی با تغییر تعداد سلولهایی که در ایجاد برگ شرکت میکنند چرخۀ تعیین شود. پیشرفت در طی مراحل مختلف سلولی نیازمند تنظیمات موقتی فعالیت پروتئینهای درگیر در همانندسازی است. در سلولی تقسیم اول بعد از فاز DNA برگ و میتوز حال در رشد متوقف میشود و برگها رشد اضافی خود را در اثر بسط و گسترش ناشی از بزرگ شدن سلول بهواسطۀ نرم شدن دیوارة سلولی و سنتز جدید ترکیبات دیوارة بهدست سلولی میآورند شناختهشدهترین عوامل در و در این میان اکسپنسینها دیوارة بسط سلولیاند.)Mitsumune et al., 2008( 1. Shoot apical meristem

8 علوم گیاهان زراعی ایران دورة 54 شمارة پاییز )2005.)Cosgrove, آزمایشهای مختلف نشان دادها دن که پروتئینهای اکسپنسین میتوانند گسترش زودرس پرایموردیای برگی اولیه را القا کنند و متعاقب آن الگوی آر شای برگی را نیز تغییر دهند )2000.)Cosgrove, شکل. مراحل مختلف رشد و نمو آرابیدوپسیس در سطح سلولی روزت و برگ )Gonzalez et al., 2012( همانطور که در نتایج این مقاله نیز تأثیر ژن بر افزایش اندازة اندامهای رویشی گیاهان تراریخت توتون بهخصوص برگها نشان داده شد این پروتئین با فعالیت سستکنندگی خود شبکههای پلیمری )نگهدارندة میکروفیبریلهای سلولزی( را هیدرولیز میکند و بسط و گسترش سلول را ناشی میشود و در نهایت تمایز سلولی و اندازة نهایی برگ شکل میگیرد )2005.)Cosgrove, هورمونهای گیاهی و اکسپنسینها ارتباط ژنهای اکسپنسین و هورمونهای گیاهی هنوز بهطور دقیق مشخص نشده است ولی آزمایشهای زیادی وجود همبستگی مثبت بین این ژنها و هورمونهایی همچون اکسین جیبرلین سیتوکینین آبسیزیکاسید و اتیلن را تأیید کردهاند. این فیتوهورمونها از طریق تنظیم میزان بیان ژنهای اکسپنسین در میزان فعالیت آنها دخالت میکنند. اخیرا در یکی از این آزمایشها Wang et (2012) al. ارتباط بین هورمونهای گیاهی IAA( )ABA و و ژنهای اکسپنسین را در گندم و تحت شرایط تنش خشکی آزمایش کردند و به این نتیجه رسیدند که افزایش ABA طی تنش اسمزی از یک طرف موجب افزایش بیان ژن اکسپنسین و متعاقبا افزایش فعالیت آنها میشود و از طرفی با افزایش ph دیواره )با کاهش فعالیت کانال ایجاد )H + -ATPase مانعی میکند. ولی بر بر سر راه فعالیت ABA خالف اکسپنسینها اکسین فعالیت اکسپنسینها را از طریق کاهش PH دیواره افزایش میدهد. عالوه بر این اکسین بهعنوان عامل افزایش طول سلول بیان برخی از ژنهای اکسپنسین را افزایش میدهد ولی بر خالف اکسین اتیلن بیان این ژنها را کاهش میدهد )2000.)Cosgrove, هورمون جیبرلین نیز بیان ها را exp افزایش میدهد. بخش عمدهای از افزایش طول )القاشده توسط )GA میانگرهها در برنج deepwater ناشی از افزایش بیان و فعالیت اکسپنسینها بوده است )2001 al.,.)lee et )1998( Dowries & Crowell با افزودن سیتوکینین به محیط کشت سویا افزایش 9-49 برابری در میزان رونوشت یک پروتئین بتااکسپنسین به نام Ciml را مشاهده کردند که نقش این فیتوهورمون دخیل در تقسیم سلولی را در تنظیم بیان اکسپنسینها نشان میدهد. بنابراین میتوان 1. Phyllotaxy 2. Cytokinin-induced message

9 1 ملکپور و عباسی: افزایش ارتفاع و سطح برگ گیاهان تراریخت توتون... گفت با تشدید بیان اکسپنسینها در گیاهان مختلف و افزایش تعداد نسخههای آنها در ژنوم گیاه احتماال میزان بیان و در نتیجه مقدار تولید این پروتئینها تحت تأثیر فیتوهورمونها بیش از پیش خواهد بود و رشد را تسریع خواهد کرد. در نهایت نتایج بهدستآمده این اجازه را به ما میدهد تا ژن را بهعنوان تنظیمکنندة رشد عمومی برای بهدست آوردن گیاهان تراریخته با اندام بزرگتر پیشنهاد کنیم که این گیاهان درشتاندام در کشاورزی جنگلداری و همچنین برای اهداف زینتی میتوانند مورد استفادة اقتصادی قرار گیرند. سپاسگزاری این پژوهش با استفاده از امکانات آزمایشگاهی و گلخانهای گروه زراعت و اصالح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران انجام پذیرفت ازاینرو از تمامی مدیران و کارکنان این گروه تشکر و قدردانی میگردد. REFERENCES 1. Cho, H. T. & Cosgrove, D. J. (2002). Regulation of root hair initiation and expansin gene expression in Arabidopsis. The Plant Cell, 14, Cho, H.T. & Cosgrove, D.J. (2004). Expansins as agents in hormone action. Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action! Davies, P.J., Ed., Dordrecht: Kluwer, Cho, H.T. & Cosgrove, D. J. (2000). Altered expression of expansin modulates leaf growth and pedicel abscission in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 97, Choi, D., Cho, H. T. & Lee, Y. (2006). Expansins: expanding importance in plant growth and development. Physiol Plant, 126, Choi, D., Lee, Y., Cho, H. T. & Kende, H. (200). Regulation of expansin gene expression affects growth and development in transgenic rice plants. Plant Cell, 15, Cosgrove, D. J. (2000). Loosening of plant cell wall by expansins. Nature, 407, Cosgrove, D. J. (2005). Growth of the plant cell wall. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, Cosgrove, D.J. (1999). Enzymes and other agents that enhance cell wall extensibility. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 50, Dowries, B. P. & Crowell, D. N. (1998). Cytokinin regulates the expression of a soybean β-expansin gene by a post-transcriptional mechanism. Plant Mol Biol, 7, Gao, X., Liu, K. & Lu, Y.T. (2010). Specific roles of atexpa1 in plant growth and stress adaptation. Russ. J. Plant Physiol, 57, Gonzalez, N., Vanhaeren, H. & Inze, D. (2012). Leaf size control: complex coordination of cell division and expansion. Trends in Plant Science, 17, Gray Mitsumune, M., Blomquist, K., mcqueen Mason, S., Teeri, T. T., Sundberg, B. & Mellerowicz, E. J. (2008). Ectopic expression of a wood_abundant expansin pttexpa1 promotes cell expansion in primary and secondary tissues in aspen. Plant Biotechnol, 6, Kuluev, B.R., Knyazev, A.B., Lebedev, Ya.P. & Chemeris, A.V. (2012). Morphological and physiological characteristics of transgenic tobacco plants expressing expansin genes: atexp10 from Arabidopsis and pnexpa1 from Poplar. Russian Journal of Plant Physiology, 59 (1), Lee, Y., Choi, D. & Kende, H. (2001). Expansins: ever-expanding numbers and functions. Curr Opin Plant Biol, 4, Li, F., Xing, S., Guo, Q., Zhao, M., Zhang, J., Wang, G. & Wang, W. (2011). Drought tolerance through overexpression of the expansin gene taexpb2 in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology, 168, Mcqueen-Mason, S. J. & Cosgrove, D. J. (2000). Disruption of hydrogen-bonding between plant-cell wall polymers by proteins that induce wall extension. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, Mcqueen-Mason, S., Durachko, D. M. & Cosgrove, D. J. )1992(. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell, 4, Rose, J. K. C., Cosgrove, D. J., Albersheim, P., Darvill, A. G. & Bennett, A. B. (2000). Detection of expansin proteins and activity during tomato ontogeny. Plant Physiology, 12, Sampedro, J. & Cosgrove, D. J. )2005(. Protein family review: expansins. Genome biology, 6, Shahnejat bushehri, S. (2010). Overexpression of in Arabidopsis Thaliana. MSc. dissertation, University of Tehran, College of Agriculture & Natural Resources, Department of Agronomy and Plant Breeding. (In Farsi) 21. Wang, W., Scali, M., Vignali, R., Milanesi, C., Petersen, A., Sari-Gorla, M. & Cresi, M. (2004). Male-sterile mutation alters Zea m1 (beta-expansin1) accumulation in a maize mutant. Plant Reprod, 17, Wu, Y., Meeley, R.B. & Cosgrove, D.J. (2001). Analysis and expression of the α-expansin and β- expansin gene families in maize. Plant Physiol, 126,

10 علوم گیاهان زراعی ایران دورة 54 شمارة پاییز 2. Wu, Y., Thorne, E.T., Sharp, R.E. & Cosgrove, D.J. (2001). Modification of expansin transcript levels in the maize primary root at low water potentials. Plant Physiol, 14, Xing, S. C., Li, F., Guo, Q. F., Liu, D. R., Zhao, X. X. & Wang, W. )2009(. The involvement of an expansin genetaexpb2 from wheat in regulating plant cell growth. Biologia Plantarum, 5 (), Zenoni, S., Reale, L., Tornielli, G. B., Lanfaloni, L., Porceddu, A., Ferrarini, A., Moretti, C., Zamboni, A., Speghini, A., Ferranti, F. & Pezzotti, M. (2004). Downregulation of the Petunia hybrida α-expansin gene phexp1reduces the amount of crystalline cellulose in cell wall and leads to phenotypic changes in petal limbs. Plant Cell, 16, Zhao, M. R., Han, Y., Feng, Y., Li, F. & Wang, W. (2012). Expansins are involved in cell growth mediated by abscisic acid and indole--acetic acid under drought stress in wheat. Plant Cell Rep, 1,